Efter de första sidoscrollande plattformsspelen introducerar Duke Nukem 3D ett förstapersonsperspektiv till serien och förvandlar spelet till en full-on shooter med 2.5D-grafik.
Dukes arsenal inkluderar pistoler, bomber, laserminor, gevär, olika raketgevär, men också hans kraftfulla ben som han träffar fiender med. Spelet har en hög nivå av interaktivitet. Många föremål i miljön kan gå sönder eller manipuleras, som biljardbord, arkadmaskiner, glas, ljusströmbrytare och säkerhetskameror. Huvudpersonen kan också ge dollar till strippor för att ta av sig topparna.
Huvudpersonen kommenterar regelbundet händelser genom en rad. Det finns tjugoåtta nivåer, uppdelade i tre avsnitt, utspelade på platser som gator, en kyrka, en rymdstation, en japansk herrgård, en fotbollsplan och många moderna miljöer.
Fiender inkluderar mestadels utomjordingar, muterade människor och poliser som har förvandlats till grispoliser. Förutom vapen har Duke också tillgång till medicinska kit, hastighetshöjande steroider, mörkerseende, skyddsstövlar, ett hologram som kallas "holoduke" och ett jetpack för att nå högre världar. Det mesta av spelet är actionorienterat, men det krävs också en mängd pussel för att gå vidare eller komma åt hemliga områden.